Clinical application research and genetic detection of fragile X syndrome based on long read sequencing

doi:10.3877/cma.j.issn.1673-5250.2024.06.008

Objective

To explore the detection performance of comprehensive analysis of fragile X syrdrome （CAFXS）based on long fragment PCR （LR-PCR）combined with long read sequencing（LRS）in the detection of fragile X mental retardation 1（FMR1）gene.

Methods

A total of 33 participants with FXS/premutation carriers and their family members who underwent expanded carrier screening or visited the genetic counseling clinic at Nanjing Women and Children's Healthcare Hospital from July 2021 to July 2023 were selected into this study.CAFXS was adopted to detect CGG repeats，AGG insertions of FMR1 gene，and single nucleotide variation （SNV），insertions/deletions（InDels），microdeletions within exon 1 of FMR1 gene.At the same time，trinucleotide repeat primer PCR （TP-PCR）combined with capillary electrophoresis（CE）was used to detect the CGG repeats，and were compared the detection results with CAFXS were compared.This study was approved by the Ethics Committee of Women and Children's Healthcare Hospital （2024KY-152）.Informed consents were obtained from participants or their guardians.

Results

①The results of CAFXS and TP-PCR/CE for detecting FMR1 genotype were consistent.Among the 33 participants，there were 10 cases of full mutation，9 cases of pre-mutation，7 cases of intermediate type and 7 cases of normal type.②Among the 33 participants，CAFXS detected 73 AGG insertions in 33 subjects，involving 36 AGG insertion patterns，among which the highest frequency was 9A9A9（24.6%）.③Among the 33 participants，CAFXS detected 9 cases （27.3%）of CGG repeats mosaicism，including pre-mutation/full-mutation mosaicism（6 cases），full-mutation mosaicism（2 cases）and normal mosaicism（1 case）.④No rare SNV，InDel and microdeletions within exon 1 of FMR1 gene were detected in 33 subjects.

Conclusions

CAFXS could analyze FMR1 gene comprehensively and accurately，and could provide more genetic information for clinical practice.

Key words: Fragile X syndrome, FMR1 gene, CGG repeat, Third-generation sequencing, Long-read sequencing, Polymerase chain reaction, Genetic diagnosis, Mosaicism, AGG insertions

图1 全突变型FXS患者（男性，年龄不祥，F25）的FMR1 基因检测图谱［图1A：TP-PCR/CE检测的CGG重复数结果图谱（“锯齿样”衰减峰为CGG 三引物扩增峰，每个扩增峰间距均约为3bp，黑色箭头所示单个扩增峰形为FMR1 基因全长扩增峰，并标识CGG重复数）；图1B：FMR1 基因瀑布图（CAFXS检测示该例患者无AGG插入，黑色箭头所示为CGG重复数）］注：FXS为脆性X 染色体综合征，TP-PCR/CE为三核苷核重复引物RCR 结合毛细管电泳，CAFXS为脆性X 染色体综合征综合分析方法，CCS为环形一致性测序

图2 全突变型受试者（女性，32岁，F33）的FMR1 基因检测图谱（该全突变型女性无FXS相关表型，推测由于X 染色体失活）［图2A：TP-PCR/CE检测CGG 重复数结果图谱（“锯齿样”衰减峰为CGG 三引物扩增峰，每个扩增峰间距约为3bp，黑色箭头所示单峰形为FMR1 基因全长扩增峰，并标识CGG 重复数）；图2B：FMR1 基因瀑布图，CAFXS检测提示2处AGG 插入（橙色竖线处），黑色箭头所示为CGG 重复数］注：FXS为脆性X 染色体综合征，TP-PCR/CE为三核苷核重复引物RCR 结合毛细管电泳，CAFXS为脆性X 染色体综合征综合分析方法，CCS为环形一致性测序

表1 本研究33例受试者的FMR1 基因的CGG 重复数及AGG 插入检测结果比较

编号	性别	家系成员	TP-PCR/CECGG重复数	CAFXS^c		突变类型	分型一致性
编号	性别	家系成员	TP-PCR/CECGG重复数	CGG重复数	AGG排布	突变类型	分型一致性
F1^a	女	-	36/60	36/60	9A9A6A9^e；10A49	前突变型	一致
F2	男	-	29	29	9A9A9	正常型	一致
F3	男	-	57	56	9A11A34	前突变型	一致
F4	男	-	5	5	5	正常型	一致
F5	女	-	33/78	33/77	10A22；9A67	前突变型	一致
F6	男	-	36	36	9A9A6A9	正常型	一致
F7	女	-	40/46	40/46	9A30；9A36	中间型	一致
F8	女	-	29/80	29/79	9A9A9；9A11A57	前突变型	一致
F9	女	-	29/46	29/46	9A9A9；9A	中间型	一致
F10	女	-	33/51	33/51	9A6A6A9；10A44	中间型	一致
F11	女	-	29/45	29/45	9A9A9；9A9A6A8	中间型	一致
F12	女	-	29/46	29/46	9A9A9；9A	中间型	一致
F13	女	-	29/45	29/45	9A9A9；9A	中间型	一致
F14	女	-	29/53	29/53	9A9A9；9A9A6A9A6A9	中间型	一致
F15	男	-	＞200	332/739^d	332；X^f	全突变型	一致
F16	女	-	29/＞200	29/634	9A9A9；X^f	全突变型	一致
F17	男	-	181/＞200d	182/248^d	9A172；9AX^f	全突变型	一致
F18	男	-	47/104/124/161/＞200^d	124/286^d	124；9A276	全突变型	一致
家系1
F19	女	先证者母亲	33/87	33/87	10A22；9A77	前突变型	一致
F20	男	先证者	＞200	280	9A270	全突变型	一致
F21	男胎	先证者母亲羊水	33	32/33^d	10A21；10A22	正常型	一致
家系2
F22	女胎	先证者羊水	29/＞200	29/303	9A9A9；303	全突变型	一致
F23	女	先证者	36/77	36/79	9A9A6A9；79	前突变型	一致
F24	男	先证者儿子	29	29	9A9A9	正常型	一致
家系3
F25	男	先证者父亲	73/＞200^d	73/233^d	73；233	全突变型	一致
F26	男	先证者爷爷	29	29	9A9A9	正常型	一致
F27	女	先证者奶奶	30/59/78^d	30/78	10A9A9；78	前突变型	一致
F28	女	先证者姑姑	29/30	29/30	9A9A9；10A9A9	正常型	一致
F29	男	先证者伯父	＞200	261/513d	261；X^f	全突变型	一致
F30	男	先证者叔叔	50/94/＞200^d>	95/246/530^d	95；246；X^f	全突变型	一致
F31	女	先证者	29/79	29/78	9A9A9；78	前突变型	一致
家系4
F32	男	先证者	122/174/＞200^d>	168/273^d	168；273	全突变型	一致
F33	女	先证者母亲	29/96/＞200^d	29/94/255^d	9A9A9；94；255	全突变型	一致

表1 本研究33例受试者的FMR1 基因的CGG 重复数及AGG 插入检测结果比较

编号	性别	家系成员	TP-PCR/CECGG重复数	CAFXS^c		突变类型	分型一致性
编号	性别	家系成员	TP-PCR/CECGG重复数	CGG重复数	AGG排布	突变类型	分型一致性
F1^a	女	-	36/60	36/60	9A9A6A9^e；10A49	前突变型	一致
F2	男	-	29	29	9A9A9	正常型	一致
F3	男	-	57	56	9A11A34	前突变型	一致
F4	男	-	5	5	5	正常型	一致
F5	女	-	33/78	33/77	10A22；9A67	前突变型	一致
F6	男	-	36	36	9A9A6A9	正常型	一致
F7	女	-	40/46	40/46	9A30；9A36	中间型	一致
F8	女	-	29/80	29/79	9A9A9；9A11A57	前突变型	一致
F9	女	-	29/46	29/46	9A9A9；9A	中间型	一致
F10	女	-	33/51	33/51	9A6A6A9；10A44	中间型	一致
F11	女	-	29/45	29/45	9A9A9；9A9A6A8	中间型	一致
F12	女	-	29/46	29/46	9A9A9；9A	中间型	一致
F13	女	-	29/45	29/45	9A9A9；9A	中间型	一致
F14	女	-	29/53	29/53	9A9A9；9A9A6A9A6A9	中间型	一致
F15	男	-	＞200	332/739^d	332；X^f	全突变型	一致
F16	女	-	29/＞200	29/634	9A9A9；X^f	全突变型	一致
F17	男	-	181/＞200d	182/248^d	9A172；9AX^f	全突变型	一致
F18	男	-	47/104/124/161/＞200^d	124/286^d	124；9A276	全突变型	一致
家系1
F19	女	先证者母亲	33/87	33/87	10A22；9A77	前突变型	一致
F20	男	先证者	＞200	280	9A270	全突变型	一致
F21	男胎	先证者母亲羊水	33	32/33^d	10A21；10A22	正常型	一致
家系2
F22	女胎	先证者羊水	29/＞200	29/303	9A9A9；303	全突变型	一致
F23	女	先证者	36/77	36/79	9A9A6A9；79	前突变型	一致
F24	男	先证者儿子	29	29	9A9A9	正常型	一致
家系3
F25	男	先证者父亲	73/＞200^d	73/233^d	73；233	全突变型	一致
F26	男	先证者爷爷	29	29	9A9A9	正常型	一致
F27	女	先证者奶奶	30/59/78^d	30/78	10A9A9；78	前突变型	一致
F28	女	先证者姑姑	29/30	29/30	9A9A9；10A9A9	正常型	一致
F29	男	先证者伯父	＞200	261/513d	261；X^f	全突变型	一致
F30	男	先证者叔叔	50/94/＞200^d>	95/246/530^d	95；246；X^f	全突变型	一致
F31	女	先证者	29/79	29/78	9A9A9；78	前突变型	一致
家系4
F32	男	先证者	122/174/＞200^d>	168/273^d	168；273	全突变型	一致
F33	女	先证者母亲	29/96/＞200^d	29/94/255^d	9A9A9；94；255	全突变型	一致

表2 本研究33例受试者的FMR1 基因的36种AGG 插入模式结果

序号	AGG插入模式	AGG插入数量（个）	频数（次）^b	比率（%）^c
1	9A9A9^a	2	14	24.56
2	9A9A6A9	3	3	5.26
3	10A22	1	3	5.26
4	9A	1	3	5.26
5	10A9A9	2	2	3.51
6	78	0	2	3.51
7	9A11A34	2	1	1.75
8	5	0	1	1.75
9	9A30	1	1	1.75
10	124	0	1	1.75
11	9A6A6A9	3	1	1.75
12	332	0	1	1.75
13	9A172	1	1	1.75
14	9A270	1	1	1.75
15	10A21	1	1	1.75
16	73	0	1	1.75
17	261	0	1	1.75
18	95	0	1	1.75
19	168	0	1	1.75
20	10A49	1	1	1.75
21	9A67	1	1	1.75
22	9A36	1	1	1.75
23	9A11A57	2	1	1.75
24	9A276	1	1	1.75
25	10A44	1	1	1.75
26	9A9A6A8	3	1	1.75
27	9A9A6A9A6A9	5	1	1.75
28	9AX	1	1	1.75
29	9A77	1	1	1.75
30	303	0	1	1.75
31	79	0	1	1.75
32	233	0	1	1.75
33	246	0	1	1.75
34	273	0	1	1.75
35	94	0	1	1.75
36	255	0	1	1.75

表2 本研究33例受试者的FMR1 基因的36种AGG 插入模式结果

序号	AGG插入模式	AGG插入数量（个）	频数（次）^b	比率（%）^c
1	9A9A9^a	2	14	24.56
2	9A9A6A9	3	3	5.26
3	10A22	1	3	5.26
4	9A	1	3	5.26
5	10A9A9	2	2	3.51
6	78	0	2	3.51
7	9A11A34	2	1	1.75
8	5	0	1	1.75
9	9A30	1	1	1.75
10	124	0	1	1.75
11	9A6A6A9	3	1	1.75
12	332	0	1	1.75
13	9A172	1	1	1.75
14	9A270	1	1	1.75
15	10A21	1	1	1.75
16	73	0	1	1.75
17	261	0	1	1.75
18	95	0	1	1.75
19	168	0	1	1.75
20	10A49	1	1	1.75
21	9A67	1	1	1.75
22	9A36	1	1	1.75
23	9A11A57	2	1	1.75
24	9A276	1	1	1.75
25	10A44	1	1	1.75
26	9A9A6A8	3	1	1.75
27	9A9A6A9A6A9	5	1	1.75
28	9AX	1	1	1.75
29	9A77	1	1	1.75
30	303	0	1	1.75
31	79	0	1	1.75
32	233	0	1	1.75
33	246	0	1	1.75
34	273	0	1	1.75
35	94	0	1	1.75
36	255	0	1	1.75

表3 TP-PCR/CE和CAFXS检测方法比较

项目	TP-PCR/CE	CAFXS
CGG重复数	＜200 CGG 重复数定量检测，＞200 CGG 重复数定性检测	最多可检测940 CGG重复^［8］
AGG插入	不能精确识别女性和嵌合等位基因的AGG插入	可检测AGG插入（包括女性和嵌合等位基因的AGG 插入）
基因内SNV/InDel	不能检测	能检测
检测嵌合灵敏度	Asuragen检测93～100、183～193、321、501～550 和931～940 CGG 重复数的下限为1%、1%、2%、2%和2%［8］	检测93～100、183～193、321、501～550 和931～940CGG重复数的下限分别为0.5%、0.5%、0.5%、1%和1%^［8］
样品需要量（ng）	20	500
操作复杂程度	简单	相对复杂
每份样品的检测成本（美元）	30～50	80（96个样品混合测序）^［8］
检测周期（d）	1～2	6～8

表3 TP-PCR/CE和CAFXS检测方法比较

项目	TP-PCR/CE	CAFXS
CGG重复数	＜200 CGG 重复数定量检测，＞200 CGG 重复数定性检测	最多可检测940 CGG重复^［8］
AGG插入	不能精确识别女性和嵌合等位基因的AGG插入	可检测AGG插入（包括女性和嵌合等位基因的AGG 插入）
基因内SNV/InDel	不能检测	能检测
检测嵌合灵敏度	Asuragen检测93～100、183～193、321、501～550 和931～940 CGG 重复数的下限为1%、1%、2%、2%和2%［8］	检测93～100、183～193、321、501～550 和931～940CGG重复数的下限分别为0.5%、0.5%、0.5%、1%和1%^［8］
样品需要量（ng）	20	500
操作复杂程度	简单	相对复杂
每份样品的检测成本（美元）	30～50	80（96个样品混合测序）^［8］
检测周期（d）	1～2	6～8

［1］	Ciobanu CG，NucǎI，Popescu R，et al.Narrative review：update on the molecular diagnosis of fragile X syndrome［J］.Int J Mol Sci，2023，24（11）：9206.DOI：10.3390/ijms24119206.
［2］	Carroll R，Shaw M，Arvio M，et al.Two novel intragenic variants in the FMR1 gene in patients with suspect clinical diagnosis of Fragile X syndrome and no CGG repeat expansion［J］.Eur J Med Genet，2020，63（10）：104010.DOI：10.1016/j.ejmg.2020.104010.
［3］	Tekendo-Ngongang C，Grochowsky A，Solomon BD，et al.Beyond trinucleotide repeat expansion in fragile X syndrome：rare coding and noncoding variants in FMR1 and associated phenotypes［J］.Genes （Basel），2021，12（11）：1669.DOI：10.3390/genes12111669.
［4］	Merenstein SA，Sobesky WE，Taylor AK，et al.Molecularclinical correlations in males with an expanded FMR1 mutation［J］.Am J Med Genet，1996，64（2）：388-394.DOI：10.1002/（SICI）1096-8628（19960809）64：2&lt；388：：AID-AJMG31&gt；3.0.CO；2-9.
［5］	Nolin SL，Glicksman A，Houck GE Jr，et al.Mosaicism in fragile X affected males［J］.Am J Med Genet，1994，51（4）：509-512.DOI：10.1002/ajmg.1320510444.
［6］	Nolin SL，Brown WT，Glicksman A，et al.Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles［J］.Am J Hum Genet，2003，72（2）：454-464.DOI：10.1086/367713.
［7］	Mei L，Hu C，Li D，et al.The incidence and clinical characteristics of fragile X syndrome in China［J］.Front Pediatr，2023，11：1064104.DOI：10.3389/fped.2023.1064104.
［8］	Liang Q，Liu Y，Liu Y，et al.Comprehensive analysis of fragile X syndrome：full characterization of the FMR1 locus by long-read sequencing［J］.Clin Chem，2022，68（12）：1529-1540.DOI：10.1093/clinchem/hvac154.
［9］	Filipovic-Sadic S，Sah S，Chen L，et al.A novel FMR1 PCR method for the routine detection of low abundance expanded alleles and full mutations in fragile X syndrome［J］.Clin Chem，2010，56（3）：399-408.DOI：10.1373/clinchem.2009.136101.
［10］	Guo Q，Chang YY，Huang CH，et al.Population-based carrier screening and prenatal diagnosis of fragile X syndrome in East Asian populations［J］.J Genet Genomics，2021，48（12）：1104-1110.DOI：10.1016/j.jgg.2021.04.012.
［11］	Hou F，Mao A，Shan S，et al.Evaluating the clinical utility of a long-read sequencing-based approach in genetic testing of fragile-X syndrome［J］.Clin Chim Acta，2023，551：117614.DOI：10.1016/j.cca.2023.117614.
［12］	Yrigollen CM，Durbin-Johnson B，Gane L，et al.AGG interruptions within the maternal FMR1 gene reduce the risk of offspring with fragile X syndrome［J］.Genet Med，2012，14（8）：729-736.DOI：10.1038/gim.2012.34.
［13］	Shen YI，Cheng KC，Wei YJ，et al.Structural dynamics role of AGG interruptions in inhibition CGG repeat expansion associated with fragile X syndrome ［J］.ACS Chem Neurosci，2024，15 （2）：230-235.DOI：10.1021/acschemneuro.3c00712.
［14］	中国医师协会医学遗传医师分会临床遗传学组，中华医学会医学遗传学分会临床遗传学组，中华预防医学会出生缺陷预防与控制专业委员会遗传病防控学组，等.脆性X 综合征的临床实践指南［J］.中华医学遗传学杂志，2022，39（11）：1181-1186.DOI：10.3760/cma.j.cn511374-20220819-00564.Clinical Genetics Group，Medical Geneticist Branch，Chinese Medical Doctor Association；Clinical Genetics Group，Medical Genetics Branch，Chinese Medical Association；Genetic Disease Prevention and Control Group，Professional Committee for Birth Defect Prevention and Control，Chinese Preventive Medicine Association，et al.Clinical practice guidelines for Fragile X syndrome［J］.Chin J Med Gene，2022，39（11）：1181-1186.DOI：10.3760/cma.j.cn511374-20220819-00564.
［15］	Zhou Y，Tang K，Law HY，et al.FMR1 CGG repeat patterns and flanking haplotypes in three Asian populations and their relationship with repeat instability［J］.Ann Hum Genet，2006，70（Pt 6）：784-796.DOI：10.1111/j.1469-1809.2006.00265.x.

[1]	Xiaoling Tie, Yi Liu, Ying Yang, Fengyu Che. Clinical features and genetic analysis of Rubinstein-Taybi syndrome：three cases report and literature review[J]. Chinese Journal of Obstetrics & Gynecology and Pediatrics(Electronic Edition), 2024, 20(04): 452-459.
[2]	Zhiqiang Sheng, Yanran Yuan. ATP1A3-related disorders: a family report and literature review[J]. Chinese Journal of Obstetrics & Gynecology and Pediatrics(Electronic Edition), 2024, 20(03): 331-338.
[3]	Jing Guo, Guoli Tian, Yanmin Wang, Zhuo Zhou, Wei Ji. Study on glucose-6-phosphate dehydrogenase and gene mutation in neonates with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency[J]. Chinese Journal of Obstetrics & Gynecology and Pediatrics(Electronic Edition), 2020, 16(06): 672-679.
[4]	Yi Xia, Qi Liang, Hong Shi, Yu Gao, Qian Xu, Shengxian Jin, Yulei He, Hui Li, Dan Li, Min Zhou. PKLR gene novel heterozygous mutation in children with pyruvate kinase deficiency[J]. Chinese Journal of Obstetrics & Gynecology and Pediatrics(Electronic Edition), 2019, 15(05): 547-553.
[5]	Chiyu Jia, Shuting Mao. Confusion, challenge and hope on diagnosis of tuberculous wound[J]. Chinese Journal of Injury Repair and Wound Healing(Electronic Edition), 2020, 15(06): 423-427.
[6]	Xueling Zeng, Siyuan Yang, Yufei Chang, Hongxin Zhao, Linghang Wang. Characteristics of respiratory pathogens and immunological features of 176 patients with human immunodeficiency virus and pulmonary infection[J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Infectious Diseases(Electronic Edition), 2024, 18(03): 142-148.
[7]	Junwen Wang, Yuan Tian, Zihao Fan, Ling Xu, Yao Gao, Yaling Cao, Zhenzhen Pan, Xiangying Zhang, Yan Song, Feng Ren. Establishment of a method for the detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA based on clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated proteins technology[J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Infectious Diseases(Electronic Edition), 2022, 16(05): 320-327.
[8]	Yao Zhang, Jiamin Chen, Man Li, Qiang Zhang, Changsong Zhao, Jie He, Rui Ma. Comparative analysis of positive rates of histopathology and multiple polymerase chain reaction detection in surgery of Brucellosis spondylitis[J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Infectious Diseases(Electronic Edition), 2021, 15(06): 419-425.
[9]	Yanghang Ou, Debo Chen, Shimu Luo, Peidong Yang, Yancheng Jiang, Zhishan Zhang. Clinical application of combined detection of breast cancer related gene CK19 with Vimentin mRNA in breast cancer[J]. Chinese Journal of Operative Procedures of General Surgery(Electronic Edition), 2021, 15(04): 422-425.
[10]	Laibang Luo, Xuyang Wang, Xuguang Hu, Youfu Zhang, Zhidan Xu. Clinical research of metagenomic next-generation sequencing in early screening of human parvovirus B19 infection after liver transplantation[J]. Chinese Journal of Transplantation(Electronic Edition), 2022, 16(06): 346-352.
[11]	Xiyao Liu, Feifei Mao, Dan Li, Dan Lu, Shengnan Wang, Huiyu Sun. The role of aqueous humor viral load and inflammatory cytokines in patients with acute retinal necrosis for the diagnosis and treatment[J]. Chinese Journal of Ophthalmologic Medicine(Electronic Edition), 2022, 12(02): 76-81.
[12]	Wanshan Zheng, Yin Yin, Zhaowei Tu, Bin Cao. Selection of internal references gene for studying trophoblast syncytialization[J]. Chinese Journal of Obstetric Emergency(Electronic Edition), 2022, 11(01): 46-52.
[13]	Wenjuan Gong, Baorong Chen, Huiying Sun, Yanhua Zheng. Analysis and solution of contamination from positive control in nucleic acid detection of SARS-CoV-2[J]. Chinese Journal of Clinical Laboratory Management(Electronic Edition), 2021, 09(04): 237-241.
[14]	Juanping Yu, Zhiqiang Li, Long Li, Qi Wei, Weijie Du, Zhen Bi, Fangyun Li, Qiong Fang, Hao Chen, Liangjun Chen, Weiling Kang, Zhihui Wang, Weiwen Cai, Meimei Yin, Ting Fang, Qianqian Wang, Shengxue Mei, Qiang Li, Zhongbao Chang, Menglai Shen, Yating Cheng, Xiaohua Li. The retrospective study on SARS-CoV-2 screening test with low nucleic acid amplification signal[J]. Chinese Journal of Clinical Laboratory Management(Electronic Edition), 2021, 09(04): 231-236.
[15]	Yong Liu, Zhengyu Zeng, Zhenjun Jiang, Danping Liu, Ran Tao, Chanjun Ren, Juan Du, Miao Li, Shuguang Xie, Weimin Liu, Genshi Li, Huiyuan Li, Yating Cheng. Practical experience of large-scale detecting 2019-nCOV in third-party independent laboratories[J]. Chinese Journal of Clinical Laboratory Management(Electronic Edition), 2020, 08(01): 54-59.

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